Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая
Медицинские изделия для диагностики IN VITRO
Описание
Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая представляет собой сыворотку крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.
Форма выпуска
Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая (10 ампул по 2 мл) в пачке из картона
Состав
Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая представляет собой сыворотку крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Консервант — борная кислота в конечной концентрации 3 %.
Показания для применения
Предназначен для постановки реакции связывания комплемента (РСК).
Способ применения
Тип анализируемого образца – сыворотка крови человека
Все работы по взятию, транспортированию и подготовке проб клинического материала осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» (для I — II групп патогенности). Хранение образцов при температуре от 2 до 8 °С.
Все исследуемые образцы должны быть промаркированы.
Перед исследованием в РСК анализируемые сыворотки следует выдержать в водяной бане (термобане) при (56±0,1) ºС в течение 30 мин для инактивации комплемента.
ПОДГОТОВКА КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
Содержимое ампулы непосредственно перед использованием развести натрия хлорида раствором 0,9 % по усиленному в 3 раза титру, указанному на этикетке.
Например, для приготовления гемолитической системы с гемолитической сывороткой, имеющей титр 1:3000, используют разведение 1:1000 (0,1 мл сыворотки в 99,9 мл натрия хлорида раствора 0,9 %). Хранить разведенную сыворотку при температуре от 2 до 8 °С не более 8 ч.
Приготовление 3% взвеси эритроцитов барана.
В день постановки реакции дефибринированную кровь трех-пятикратно отмывают 0,9 % раствором натрия хлорида путем центрифугирования, центрифугируют 10 минут при 2000 оборотов в минуту.
Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка готовят 3 % взвесь эритроцитов барана в 0,9 % растворе натрия хлорида (3 мл осадка эритроцитов разводят в 97 мл 0,9 % растворе натрия хлорида). 3 % взвесь эритроцитов барана используют в течение 1 сут. При наличии гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.
Приготовление гемолитической системы. Гемолитическую систему готовят из смеси равных объемов 3 % взвеси эритроцитов барана и сыворотки гемолитической в тройном титре. Причем гемолитическую сыворотку следует добавлять к взвеси эритроцитов, следуя нормативным и методическим документам. Систему прогревают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение (30±1) мин.
Подготовку других реагентов, используемых для РСК осуществлять согласно инструкции по применению реагентов.
ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
Проведение РСК, учет и интерпретация результатов в соответствии нормативными и методическими документами в зависимости от определяемого аналита.
Меры предосторожности при применении
Класс потенциального риска применения – 2а.
Изделие является безопасным, не приносит вреда окружающей природной среде и здоровью человека при транспортировании, хранении, применении. Компоненты изделия являются негорючими, невзрывоопасными, не способными самовозгораться, не радиоактивными, нетоксичными, не обладают канцерогенным, мутагенным действием или отрицательно влияющим на репродуктивную функцию человека, в том числе не образуют токсичных соединений с другими веществами, не обладают кумулятивными свойствами.
Изделие содержит материал животного происхождения: сыворотку крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана, безопасность которой подтверждена. Сыворотка кролика, используемая в производстве, получена от животных, прошедших ветеринарный контроль и находящихся под наблюдением.
Однако исследуемые образцы, а также их растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте, следует рассматривать как потенциально инфицированные. При работе следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с:
— ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО 15190:2003) «Лаборатории медицинские. Требования безопасности»;
— СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» (при определении возбудителей 1 и II групп патогенности).
— СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»;
— СП 1.3.2518-09 «Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней;
— СП 1.3.2885-11 «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
При работе с потенциально инфицированными биологическими образцами, оборудованием, материалами, изделиями, находящимися с ними в контакте, следует соблюдать осторожность:
— работать в боксах биологической безопасности с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды, одноразовых резиновых перчаток, шапочки);
— не пипетировать ртом;
— в случае пролива образцов и рабочих растворов на рабочие поверхности, необходимо проводить дезинфекционную обработку с использованием дезинфицирующих средств, разрешенных к использованию на территории РФ;
— инструменты и оборудование (после работы с биологическими образцами), подвергать обработке с использованием дезинфицирующих средств, разрешенных к использованию на территории РФ;
– избегать образования аэрозолей, попадания исследуемых образцов и их растворов, компонентов изделия в рот, их проглатывания, контакта с кожей и слизистыми оболочками;
– утилизировать все использованные материалы, исследуемые образцы и их растворы в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами.
Назначение
Медицинское изделие для диагностики ин витро Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая предназначено для постановки реакции связывания комплемента (РСК).
Функциональное назначение — вспомогательное средство в диагностике.
Показания к применению изделия в соответствии с его назначением.
Противопоказания для применения изделия согласно инструкции отсутствуют.
Характеристика набора
Состав:
Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая — 10 ампул по 2 мл
Комплектация. Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая (10 ампул по 2 мл) в пачке из картона с инструкцией по применению, паспорт (в комплекте поставки).
Характеристика компонентов изделия.
Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая представляет собой сыворотку крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Консервант — борная кислота в конечной концентрации 3 %.
Сыворотка имеет вид опалесцирующей жидкости светло-желтого или слабо-розового цвета без осадка и хлопьев.
При хранении может появиться пленка на поверхности сыворотки или пристеночное беловатое кольцо на дне, что не отражается на качестве сыворотки.
* Примечание – Биологические материалы баранов и кроликов, используемые для производства получены от животных, прошедших ветеринарный контроль и находящихся под наблюдением.
Принцип действия РСК заключается в том, что если в образце присутствуют специфические антитела к антигенам аналитической системы — образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. В качестве индикатора используют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Если образовался иммунный комплекс, то комплемент связан и гемолиза не происходит. Если в образце отсутствуют специфические антитела, комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается свободным, что вызывает гемолиз.
Изделие предназначено для лабораторной диагностики для однократного применения по назначению. Вид аналита – качетвенный/полуколичественный.
Изделие рассчитано на проведение не менее 500 анализов в пробирках.
Изделие ремонту и обслуживанию не подлежит. Монтаж, наладка, калибровка и про-чие операции, необходимые для ввода МИ в эксплуатацию и его правильной эксплуатации не требуются. Изделие является нестерильным.
Пользователями изделия могут быть медицинские специалисты бактериологических лабораторий медицинских организаций с высшим и средним специальным образованием, прошедшие специальную подготовку и допущенные к работе с патогенными микроорганизмами в соответствии с СП 1.3.2322-08 и СП 1.3.3118-13 (при определении возбудителей 1 и II групп патогенности).
Функциональные характеристики
Специфическая активность. Титр сыворотки в РСК должен быть не ниже 1:1200
Чувствительность. В разведении не ниже 1:1200 в присутствии комплемента должна вызывать гемолиз эритроцитов барана.
Специфичность. В разведении не ниже 1:1200 в присутствии комплемента должна вызывать гемолиз эритроцитов барана и не должна лизировать их в разведении 1:100 в отсутствии комплемента.
Меры предосторожности
Класс потенциального риска применения – 2а.
Изделие является безопасным, не приносит вреда окружающей природной среде и здоровью человека при транспортировании, хранении, применении. Компоненты изделия являются негорючими, невзрывоопасными, не способными самовозгораться, не радиоактивными, нетоксичными, не обладают канцерогенным, мутагенным действием или отрицательно влияющим на репродуктивную функцию человека, в том числе не образуют токсичных соединений с другими веществами, не обладают кумулятивными свойствами.
Изделие содержит материал животного происхождения: сыворотку крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана, безопасность которой подтверждена. Сыворотка кролика, используемая в производстве, получена от животных, прошедших ветеринарный контроль и находящихся под наблюдением.
Однако исследуемые образцы, а также их растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте, следует рассматривать как потенциально инфицированные. При работе следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с:
— ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО 15190:2003) «Лаборатории медицинские. Требования безопасности»;
— СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» (при определении возбудителей 1 и II групп патогенности).
— СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»;
— СП 1.3.2518-09 «Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней;
— СП 1.3.2885-11 «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
При работе с потенциально инфицированными биологическими образцами, оборудованием, материалами, изделиями, находящимися с ними в контакте, следует соблюдать осторожность:
— работать в боксах биологической безопасности с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды, одноразовых резиновых перчаток, шапочки);
— не пипетировать ртом;
— в случае пролива образцов и рабочих растворов на рабочие поверхности, необходимо проводить дезинфекционную обработку с использованием дезинфицирующих средств, разрешенных к использованию на территории РФ;
— инструменты и оборудование (после работы с биологическими образцами), подвергать обработке с использованием дезинфицирующих средств, разрешенных к использованию на территории РФ;
– избегать образования аэрозолей, попадания исследуемых образцов и их растворов, компонентов изделия в рот, их проглатывания, контакта с кожей и слизистыми оболочками;
– утилизировать все использованные материалы, исследуемые образцы и их растворы в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами.
Утилизация изделий, пришедших в негодность, с истекшим сроком годности и неиспользованных изделий осуществляется в соответствии с требованиями СП 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
Оборудование и реагенты
термостат (37±1) °С;
центрифуга лабораторная (2 тыс. об/мин);
термобаня (56±1) ºС;
пробирки стеклянные (ГОСТ 25336);
пипетки (ГОСТ 29227) 2-го класса точности
дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема со сменными наконечниками;
натрия хлорида раствор 0,9 %;
эритроциты барана (возраст барана 1-5 лет);
перчатки одноразовые;
дезинфицирующие растворы.
Анализируемые пробы
Тип анализируемого образца – сыворотка крови человека
Все работы по взятию, транспортированию и подготовке проб клинического материала осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» (для I — II групп патогенности). Хранение образцов при температуре от 2 до 8 °С.
Все исследуемые образцы должны быть промаркированы.
Перед исследованием в РСК анализируемые сыворотки следует выдержать в водяной бане (термобане) при (56±0,1) ºС в течение 30 мин для инактивации комплемента.
Проведение анализа
Меры по снижению рисков при применении изделия
Объективные результаты анализа гарантируются при выполнении следующих условий:
— строгое соблюдение настоящей инструкции по применению;
— соблюдение правил асептики при работе;
— соблюдение температурного режима, режима обработки используемой посуды;
— соблюдение условий хранения изделия (хранение в герметично упакованном виде) и транспортирования. Изделия, транспортированные и хранившиеся с нарушением температурного режима, применению не подлежат;
— не использовать изделие при отсутствии на его упаковке соответствующей маркировки, нарушении целостности внутренней упаковки, разных серий изделия.
Подготовка компонентов для исследования (анализа)
Содержимое ампулы непосредственно перед использованием развести натрия хлорида раствором 0,9 % по усиленному в 3 раза титру, указанному на этикетке.
Например, для приготовления гемолитической системы с гемолитической сывороткой, имеющей титр 1:3000, используют разведение 1:1000 (0,1 мл сыворотки в 99,9 мл натрия хлорида раствора 0,9 %). Хранить разведенную сыворотку при температуре от 2 до 8 °С не более 8 ч.
Приготовление 3% взвеси эритроцитов барана.
В день постановки реакции дефибринированную кровь трех-пятикратно отмывают 0,9 % раствором натрия хлорида путем центрифугирования, центрифугируют 10 минут при 2000 оборотов в минуту.
Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка готовят 3 % взвесь эритроцитов барана в 0,9 % растворе натрия хлорида (3 мл осадка эритроцитов разводят в 97 мл 0,9 % растворе натрия хлорида). 3 % взвесь эритроцитов барана используют в течение 1 сут. При наличии гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.
Приготовление гемолитической системы. Гемолитическую систему готовят из смеси равных объемов 3 % взвеси эритроцитов барана и сыворотки гемолитической в тройном титре. Причем гемолитическую сыворотку следует добавлять к взвеси эритроцитов, следуя нормативным и методическим документам. Систему прогревают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение (30±1) мин.
Подготовку других реагентов, используемых для РСК осуществлять согласно инструкции по применению реагентов.
Проведение исследования (анализа)
Проведение РСК, учет и интерпретация результатов в соответствии нормативными и методическими документами в зависимости от определяемого аналита.
Условия хранения и эксплуатация набора
Транспортирование всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8 °С. Допускается кратковременное (до 48 ч) транспортирование при температуре от 9 до 25 °С.
Хранение в упаковке изготовителя в течение всего срока годности при температуре от 2 до 8 °С.
Хранение компонентов после вскрытия упаковки при температуре от 2 до 8 °С в герметично закрытом виде (в условиях, предотвращающих бактериальный пророст) не более 1 месяца.
ГОСТ 16445-2012
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
СЫВОРОТКА ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ ДЛЯ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Технические условия
Serum haemolitic for the complement fixation test. Specification
МКС 11.220
Дата введения 2014-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 54-П от 3 декабря 2012 г. N 54-П*)
За принятие проголосовали:
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 |
Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 |
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Армения |
AM |
Минэкономики Республики Армения |
|
Киргизия |
KG |
Кыргызстандарт |
|
Молдова |
MD |
Молдова-Стандарт |
|
Россия |
RU |
Росстандарт |
|
Таджикистан |
TJ |
Таджикстандарт |
|
Узбекистан |
UZ |
Узстандарт |
4 ВЗАМЕН ГОСТ 16445-78
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 316-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 года
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная на официальном сайте Росстандарта России rst.gov.ru по состоянию на 11.11.2024
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на гемолитическую сыворотку для реакции связывания комплемента (далее — сыворотка), представляющую собой консервированную глицерином сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана.
Сыворотка предназначена для применения в качестве компонента реакции связывания комплемента (далее — РСК) в ветеринарии.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9142-90 Ящики из гофрированного картона. Общие технические условия
ГОСТ 12301-2006 Коробки из картона, бумаги и комбинированных материалов. Общие технические условия
ГОСТ 12303-80 Пачки из картона, бумаги и комбинированных материалов. Общие технические условия
ГОСТ 14192-90* Маркировка грузов
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 22524-77 Пикнометры стеклянные. Технические условия.
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования и методы испытаний.
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части не затрагивающей эту ссылку.
3 Технические требования
3.1 Сыворотка должна соответствовать требованиям настоящего стандарта и производиться по технологическому регламенту.
3.2 По физико-химическим и биологическим свойствам сыворотка должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.
Таблица 1
|
Наименование показателя |
Характеристика и норма |
|
Внешний вид |
Прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость желтого цвета с розовым оттенком без хлопьев, осадка и посторонней примеси |
|
Массовая доля глицерина, % |
50±5 |
|
Стерильность |
Посевы на питательные среды не должны давать роста бактериальной микрофлоры в течение 10 сут при выдерживании в термостате при температуре (37,5±0,5)°С и грибов при температуре (21±1)°С |
|
Гемолитические свойства |
Не должна вызывать гемолиза эритроцитов барана |
|
Активность, титр, не менее |
1:1000 |
3.3 Упаковывание, маркирование
3.3.1 Сыворотку расфасовывают по 1 см
в стерильные ампулы из нейтрального стекла и запаивают.
На ампулы наносят маркировку с указанием:
— наименования организации-производителя;
— наименования сыворотки;
— номера серии;
— даты выпуска;
— количества сыворотки в ампуле, см
;
— срока годности;
— надписи: «Для ветеринарного применения».
3.3.2 Ампулы с сывороткой упаковывают в картонные коробки по ГОСТ 12301 или пачки по ГОСТ 12303 с разделительными перегородками (прокладками), обеспечивающими их сохранность при транспортировании и хранении.
3.3.3 На каждую коробку наклеивают этикетку, на которой указывают:
— наименование организации-производителя и ее товарный знак;
— наименование сыворотки;
— количество ампул в коробке;
— количество сыворотки в ампуле, см
;
— количество доз в ампуле;
— номер серии;
— дату выпуска;
— срок годности;
— титр;
— условия хранения;
— надпись: «Для ветеринарного применения»;
— обозначение настоящего стандарта;
— штриховой код;
— информацию о подтверждении соответствия;
— предупредительную надпись: «Разводить без учета содержания глицерина!».
3.3.4 Коробки с сывороткой упаковывают в картонные ящики по ГОСТ 9142 или аналогичные массой брутто не более 15 кг. Внутрь каждого ящика вкладывают контрольный лист с указанием:
— наименования сыворотки,
— номера серии,
— даты упаковки,
— фамилии или номера упаковщика.
3.3.5 Каждый ящик (транспортная тара) маркируют по ГОСТ 14192 с указанием манипуляционных знаков: «Хрупкое. Осторожно», «Ограничение температуры».
3.3.6 Маркировка, характеризующая упакованную продукцию, должна содержать следующую информацию:
— наименование организации-производителя и ее адрес (в том числе страну);
— наименование сыворотки;
— число коробок в ящике;
— номер серии;
— дату выпуска;
— условия хранения и перевозки;
— массу брутто;
— надпись: «Для ветеринарного применения».
4 Правила приемки
4.1 Каждая серия сыворотки должна быть принята (проверена) отделом, отвечающим за контроль качества готовой продукции организации-производителя в соответствии с нормативными документами государства, принявшего стандарт.
4.2 Серией сыворотки считают определенное количество сыворотки, полученное за один технологический цикл, одновременно представленное на контроль и оформленное одним документом о качестве.
4.3 В документе о качестве указывают:
— наименование организации-производителя;
— наименование сыворотки;
— номер серии;
— дату изготовления (месяц и год);
— объем серии;
— результаты испытания по показателям качества;
— срок годности (месяц и год);
— условия хранения;
— обозначение стандарта;
— номер и дату выдачи документа о качестве;
— заключение и подпись лица, выдавшего документ о качестве.
4.4 Для контроля качества сыворотки от каждой серии отбирают выборку. Из выборки выделяют среднюю пробу в количестве 40 ампул. 20 ампул с сывороткой используют для проведения испытания по показателям качества, указанным в таблице 1, а 20 ампул направляют в архив организации-производителя. Пробы в архиве хранят в течение срока годности.
4.5 Архивные образцы маркируют надписью «Архив», опечатывают и снабжают документом установленной формы с указанием:
— наименования сыворотки;
— номера серии;
— даты выпуска (месяц и год);
— даты отбора проб;
— объема серии;
— числа отобранных образцов;
— должности и подписи лица отобравшего пробы;
— срока годности (месяц и год);
— обозначения настоящего стандарта;
— срока хранения проб в архиве.
4.6 При неудовлетворительных результатах испытаний хотя бы по одному из показателей по нему проводят повторные испытания на удвоенном количестве проб сыворотки, взятой от той же серии и на удвоенном количестве материалов. Результаты повторных испытаний считают окончательными и распространяют на всю серию.
В случае неудовлетворительных результатов повторной проверки серию сыворотки считают не соответствующей требованиям настоящего стандарта, ее бракуют и уничтожают путем раздавливания ампул с последующим разведением содержимого ампул водой в соотношении 1:100 и сливом образующегося раствора в промышленную канализацию, о чем составляют соответствующий акт.
4.7 Контроль качества сыворотки, поступающей по рекламации, проводит организация-производитель, а при разногласиях в оценке качества между производителем и потребителем контроль проводит организация, уполномоченная в порядке, действующем на территории государства, принявшего стандарт.
5 Методы испытаний
5.1 Для определения внешнего вида, наличия посторонней примеси, хлопьев и осадка ампулы с сывороткой встряхивают и просматривают в проходящем свете.
Содержимое ампул должно представлять собой прозрачную, слегка опалесцирующую жидкость желтого цвета с розовым оттенком без хлопьев, осадка и посторонней примеси.
5.2 Определение массовой доли глицерина
5.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
— пикнометр вместимостью 1-2 см
— баню водяную или термостат;
— термометр технический стеклянный ртутный со шкалой от 0°С до 100°С и ценой деления 1°С по ГОСТ 28498;
— весы лабораторные аналитические;
— эксикатор по ГОСТ 25336;
— пипетки градуированные для отбора жидкости по ГОСТ 29227;
— воду дистиллированную по ГОСТ 6709, кипяченую или бидистиллированную.
5.2.2 Подготовка к испытанию
Пикнометр тщательно очищают хромовой смесью, промывают водой, ополаскивают спиртом, затем эфиром, высушивают продуванием воздуха или в сушильном шкафу и охлаждают в эксикаторе.
5.2.3 Проведение испытания
Пикнометр взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0002 г. Наполняют его дистиллированной водой до метки, выдерживают на водяной бане или в термостате при температуре 20 °С в течение 20-30 мин и вновь корректируют заполнение водой до метки. Затем пикнометр обтирают и взвешивают на аналитических весах. Освобождают пикнометр от воды, сушат, как указано выше, и заполняют испытуемой гемолитической сывороткой. Дальнейшие процедуры проводят так же, как при определении массы воды.
5.2.4 Обработка результатов
Плотность гемолитической сыворотки
, содержащей глицерин, г/см
, вычисляют по формуле
, (1)
где
— масса пробы сыворотки в объеме пикнометра, г;
— масса пробы воды в объеме пикнометра, г.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,0008 г/см
.
Плотность гемолитической сыворотки
должна составлять 1,115-1,145 г/см
, что соответствует 45%-55% массовой доли глицерина в сыворотке.
5.3 Определение стерильности
Стерильность сыворотки определяют по ГОСТ 28085.
Сыворотка должна быть стерильной.
5.4 Определение активности (титра) и гемолитических свойств
Активность гемолитической сыворотки определяют по показателю 100%-ного гемолиза эритроцитов барана в гемолитической системе. Титрование гемолитической сыворотки производится комплементом для реакции связывания комплемента ГОСТ 16446 с титром 0,08-0,14 в гемолитической системе.
Титром гемолитической сыворотки следует считать наибольшее ее разведение (наименьшее количество), при котором в течение 10 мин при температуре 37
°
С-38°С наступает полный (100%-ный) гемолиз 0,2 см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,2 см
комплемента в разведении 1:20 в общем объеме жидкости 1,0 см
.
Сыворотка должна характеризоваться полным отсутствием гемолиза эритроцитов барана в пробирке без комплемента.
5.4.1 Оборудование и реактивы
Для проведения испытания применяют:
— штативы;
— пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;
— стаканы лабораторные, колбы по ГОСТ 25336;
— колбы мерные вместимостью 100, 500 и 1000 см
— пипетки вместимостью до 10 см
с ценой деления 0,1 см
— пипетки вместимостью 1 см
с ценой деления 0,01 см
— баню водяную;
— маркеры по стеклу;
— физиологический раствор рН 6,8-7,2.
5.4.2 Подготовка к испытанию
5.4.2.1 Подготовка разведений гемолитической сыворотки
Готовят исходное разведение гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 см
гемолитической сыворотки и 9,9 см
физиологического раствора), из которого готовят разведения от 1:500 до 1:2000 (см. таблицу 2).
Таблица 2
|
Объем исходного разведения, см
|
Объем физиологического раствора, см
|
Общий объем, см
|
Получаемое разведение |
|
0,2 |
0,8 |
1,0 |
1:500 |
|
0,2 |
1,3 |
1,5 |
1:750 |
|
0,2 |
1,8 |
2,0 |
1:1000 |
|
0,2 |
2,3 |
2,5 |
1:1250 |
|
0,2 |
2,8 |
3,0 |
1:1500 |
|
0,2 |
3,3 |
3,5 |
1:1750 |
|
0,2 |
3,8 |
4,0 |
1:2000 |
Разведения сыворотки приготовлены с учетом массовой доли в ней глицерина (50%), поэтому при расчете количества сыворотки для постановки РСК следует исходить из ее титра, не учитывая содержание глицерина, то есть при титре сыворотки 1:1000 ее удвоенный титр будет 1:500, для приготовления которого следует взять 0,1 см
сыворотки и 49,9 см
физиологического раствора; при титре 1:1500 удвоенный титр 1:750 (0,1 см
сыворотки и 74,9 см
физиологического раствора) и т.д.
5.4.2.2 Подготовка 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана
Кровь у барана берут с утра до кормления из яремной вены во флакон со стеклянными (керамическими) бусами и интенсивно перемешивают круговыми движениями флакона в процессе взятия и в течение 7 мин после. Затем фильтруют через марлю и отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин по 15-10 мин до полного обесцвечивания промывной жидкости, но не более четырех раз. Из осадка эритроцитов готовят 2,5%-ную взвесь на физиологическом растворе.
5.5 Проведение испытания
5.5.1 По 0,2 см
каждого разведения сыворотки переносят в серологические пробирки с указанием разведений, начиная с наибольшего разведения (1:2000). Во все пробирки вносят по 0,2 см
комплемента в разведении 1:20, по 0,4 см
физиологического раствора и по 0,2 см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана.
Одновременно в этот же штатив ставят три пробирки для контроля.
В пробирки вносят:
в первую:
— 0,2 см
гемолитической сыворотки в разведении 1:100;
— 0,6 см
физиологического раствора;
— 0,2 см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана;
во вторую:
— 0,2 см
комплемента в разведении 1:20;
— 0,6 см
физиологического раствора;
— 0,2 см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана;
в третью:
— 0,2 см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана;
— 0,8 см
физиологического раствора.
В первой контрольной пробирке определяют гемолитические свойства сыворотки, во второй — гемолитические свойства комплемента, в третьей — резистентность эритроцитов барана (таблица 3).
Таблица 3
|
Компоненты |
Дозы компонентов при разведении гемолитической сыворотки, см
|
Номера контрольных пробирок |
|||||||||
|
1:100 |
1:500 |
1:750 |
1:1000 |
1:1250 |
1:1500 |
1:1750 |
1:2000 |
1 |
2 |
3 |
|
|
Гемолизин |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
— |
— |
|
Комплемент 1:20 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
— |
0,2 |
— |
|
Физиологический раствор |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,6 |
0,6 |
0,8 |
|
Эритроциты барана (2,5%-ная взвесь) |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
|
Водяная баня 37°С-38°С — 10 мин |
|||||||||||
|
Примерный результат |
ПГ |
ПГ |
ПГ |
ПГ |
ПГ |
ПГ |
ЧГ |
ЧГ |
ОГ |
ОГ |
ОГ |
|
Примечание — ПГ — полный гемолиз; ЧГ — частичный гемолиз; ОГ — отсутствие гемолиза. |
Штатив встряхивают и переносят в водяную баню на 10 мин при температуре 37°С-38°С. Штатив с пробирками извлекают из бани и немедленно проводят учет результатов реакций в проходящем свете.
5.5.2 Учет результатов
Сыворотку считают активной при титре не менее 1:1000 и при отсутствии гемолиза эритроцитов в контрольных пробирках.
6 Транспортирование и хранение
6.1 Гемолитическую сыворотку транспортируют всеми видами крытого транспорта.
Допускается транспортирование гемолитической сыворотки при температуре не выше 20°С, при этом срок транспортирования не должен превышать более 5 сут.
6.2 Гемолитическую сыворотку хранят в чистом, темном помещении при температуре от 2°С до 8°С.
(Поправка).
6.3 Срок годности гемолитической сыворотки — три года с даты изготовления. Датой изготовления считают дату расфасовки. Датой выпуска гемолитической сыворотки считают дату подписания документа о качестве.
|
УДК 612.398.12: 619. 006.354 |
МКС 11.220 |
|
Ключевые слова: сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента, технические требования, правила приемки, методы испытаний, транспортирование и хранение |
Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента
Состав
Препарат представляет собой консервированную глицерином сыворотку крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, и имеет вид прозрачной, слегка опалесцирующей жидкости желтовато-розового цвета.
Назначение
Сыворотка применяется в качестве компонента реакции связывания комплемента. Препарат высоко специфичен и активен, применяемый метод консервации нативной сыворотки обеспечивает стабильность её гемолитической активности при хранении.
Применение
Сыворотку используют в соответствии с инструкцией по применению. Титр не менее 1:1000.
Форма выпуска
Выпускается в ампулах вместимостью 2 см3 по 8750 доз (1 мл) препарата. В коробке 10 ампул.
Хранение
Сыворотка гемолитическая сохраняет биологические свойства в течение 3 лет с даты изготовления и хранении её в сухом, темном месте при температуре от 2 °С до 8 °С.
Показания: является одним из компонентов для реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК).
Форма выпуска, описание и состав компонентов наборов: сыворотка кроличья гемолитическая (rabbit haemolytic serum) – лиофилизированная, представляет собой сыворотку крови кроликов иммунизированных эритроцитами баранов.
Объём/Доза: 1.0 см3.
Первичная упаковка: Стеклянные флаконы плотно укупорены резиновыми пробками и обкатаны алюминиевыми колпачками с индикатором вскрытия «FLIP-OFF».
Вторичная упаковка: Флаконы упакованы в коробки с разделительными перегородками для обеспечения их целостности. Каждая коробка содержит наставления для применения.
Условия хранения: Флаконы следует хранить и транспортировать при температуре от 2°С до 8°С в тёмном месте. Не замораживать.
Срок годности: 36 месяцев.
Продукт изготовлен в соответствии с требованиям МЭБ (OIE) и стандарта GMP.
Глава 11. АГГЛЮТИНИРУЮЩИЕ, ПРЕЦИПИТИРУЮЩИЕ, ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ И ЛЮМИНИСЦИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ. КОМПЛЕМЕНТ
Диагностические иммунные сыворотки широко применяются для определения вида или типа микроба, выделенного от больного или носителя и для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии. Приготовление диагностических сывороток в принципе не отличается от приготовления лечебно-профилактических сывороток. В зависимости от характера антигена, послужившего для иммунизации животного, сыворотка последнего приобретает различные свойства.
Специфические свойства иммунных сывороток могут быть обнаружены путем изучения действия их на соответствующие антигены. В зависимости от условий опыта у таких сывороток можно наблюдать агглютинирующее (склеивающее), преципитирующее (осаждающее) и литическое (растворяющее) действие. Применительно к наблюдаемым феноменам принято говорить о соответствующих иммунных телах, содержащихся в сыворотках: агглютининах, преципитинах, лизинах и пр.
Агглютинирующие сыворотки
При идентификации микробов, наряду с определением морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические агглютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием специфических антител — агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке.
Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Микробная клетка является сложным комплексом антигенов, что является причиной так называемой групповой агглютинации, выражающейся в том, что иммунная сыворотка агглютинирует не только гомологичный микроб, но и другие бактерии из той же группы. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания.
Устранить групповую агглютинацию можно, удалив из сыворотки антитела в отношении антигенов, являющихся общими для гомологичного микроба и для родственных с ним. Это достигается путем смешения небольшого количества сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что ведет к адсорбции на их поверхности соответствующих антител. В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба.
Иммунные сыворотки, лишенные антител к групповым антигенам и сохранившие лишь антитела к тому специфическому антигену, которым характеризуется гомологичная культура, получили название монорецепторных.
Антитела, обусловливающие агглютинацию бактерий и иных клеток, получили название агглютининов, а сыворотки, содержащие эти антитела, агглютинирующих. Сыворотки получаются путем иммунизации животных соответствующими микробами. В качестве продуцентов агглютинирующих сывороток могут быть использованы кролики, бараны, козы, ослы и лошади. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов.
Для иммунизации животных можно применять живые и убитые культуры, являющиеся типичными по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим и антигенным свойствам. Лучшие результаты получаются при применении формалинизированных и обработанных парами формалина микробных взвесей. Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену, начиная с 500 млн. микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3-4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5-7 день после третьей иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки. Титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, с которым получается реакция агглютинации соответствующей культуры, оцениваемая тремя крестами при помощи агглютиноскопа. При получении недостаточного титра, кролик подвергается 4-й иммунизации в той же дозе или в удвоенной, в зависимости от веса и состояния животного.
Если титр сыворотки оказывается достаточным, то в тот же день у кролика производится кровопускание. Кровь можно получить тремя способами:
1) из ушной вены;
2) из сердца;
3) из сонной артерии (тотальное кровопускание).
На наружной поверхности уха в месте сплетения кровеносных сосудов делается надрез бритвенным ножичком и кровь по каплям собирается в большую стерильную пробирку. После взятия крови кролику подкожно вводится стерильный физиологический раствор (не менее половины объема взятой крови). Взятие крови из уха кролика следует производить 2 раза с интервалом в 2 дня. За два кровопускания от одного кролика получается 80-120 мл крови.
Взятие крови из сердца производится однократно, в количестве 40-60 мл. Козам, ослам и баранам антиген первый раз вводится подкожно, а в дальнейшем внутривенно, с интервалами в 5 дней. У крупных животных (бараны, козы, ослы, лошади) кровопускание производится через яремную вену.
Полученная кровь ставится на 10-15 минут в термостат, образовавшийся сгусток отделяется от стенок пробирки, после чего кровь выдерживается в течение 24-48 часов в рефрижераторе при температуре 4-8 °С. В настоящее время от крупных животных (лошади, ослы и др.) кровь берут в бутыли с цитратным раствором. Плазму дефибринируют раствором хлористого кальция.
К полученной сыворотке добавляется консервант. Сыворотка (в нативном виде) выдерживается не менее 1 месяца при температуре 4-8 °С для стабилизации титра, после чего определяется окончательный титр ее к гомологичным штаммам и. наличие групповой реакции путем постановки реакции агглютинации с набором соответствующих живых культур в количестве 3-5 штаммов каждого вида. Титр групповых агглютининов не должен превышать 1/8 титра к гомологичным культурам.
Институтами вакцин и сывороток выпускаются неадсорбированные и адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные агглютинирующие сыворотки получают путем удаления методом адсорбции неспецифических и групповых антител из нативных сывороток. Использование адсорбированных сывороток дает возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой агглютинации.
Для адсорбции агглютинирующих сывороток в качестве адсорбента могут применяться живые и убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая культура, содержащая все антигенные компоненты в неизмененном виде. Полученные микробные взвеси перед употреблением центрифугируются в необходимом количестве и добавляются к адсорбируемой сыворотке. Адсорбцию сывороток следует начинать адсорбентами, имеющими близкое родство с культурой, примененной для получения данной сыворотки. Количество добавленного антигена зависит от вида или типа истощаемой сыворотки и от ее количества.
Сыворотка с адсорбентом помещается в термостат при 37 °С на срок от 2 до 18 часов и затем в рефрижератор до следующего дня. Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с культурами, реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными, культурами.
Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных тел путем центрифугирования или сепарирования. Если к нативной сыворотке не добавлялся консервант, то к полученной серии сыворотки следует добавить 1-2 % перекристаллизованной борной кислоты. Затем сыворотка фильтруется через стерилизующий бактериальный фильтр и после выдерживания в течение 2-х суток при комнатной температуре испытывается на стерильность, специфичность и высоту титра.
Контроль на специфичность адсорбированных агглютинирующих сывороток проводится до и после фильтрования — реакцией агглютинации на стекле и развернутой реакцией агглютинации с гомологичными и гетерологичными культурами. Ясно выраженная положительная реакция агглютинации, получаемая с 3-5 гомологичными культурами в течение 1 минуты при комнатной температуре, при отсутствии реакции агглютинации с культурами других серологических типов в течение 20 минут служит критерием для выпуска адсорбированных сывороток. Диагностические агглютинирующие сыворотки разливаются по 1 мл в соответствующие ампулы, которые упаковываются по нескольку штук (не более 10) в коробку.
Агглютинирующие сыворотки необходимо хранить в темном сухом месте при 4-10 °С. При правильном содержании сыворотка сохраняет свою активность в течение одного года со дня изготовления.
Агглютинирующие адсорбированные сыворотки выпускаются и в сухом виде. Сыворотки перед высушиванием в стерильных условиях разводят сахарозо-желатиновой средой, разливают по 1 мл в стерильные ампулы и высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.
Преципитирующие сыворотки
Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии, в судебно-медицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови, в санитарии, химии и т.д.
Реакция преципитации характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить ничтожные следы антигена (до разведения 1:100000 и выше). Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих.
Преципитирующие сыворотки получаются путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток. Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, а также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.
Наилучшие преципитирующие сыворотки получаются при иммунизации полным антигеном или соляно-кислой вакциной. Применяемую для иммунизации животных экстрагированную соляно-кислую вакцину готовят следующим образом: густой смыв суточной культуры дважды промывают (при центрифугировании) физиологическим раствором и обрабатывают десятикратным количеством 0,2 N соляной кислоты в течение 18-24 часов при температуре 37 °С. Затем центрифугируют, полученный осадок микробных тел дважды промывают физиологическим раствором и нейтрализуют 25 % раствором углекислой соды. Полученную вакцину оставляют в виде осадка.
По мере надобности из этого осадка готовят взвесь в физиологическом растворе, содержащую необходимое для иммунизации количество микробных тел, определяемое по оптическому стандарту. При такой обработке в вакцине остается часть полного антигена и происходит разрушение лабильных токсических белков, в результате чего сохраняется антигенность и достигается относительная атоксичность препарата.
Преципитирующие сыворотки готовятся подобно агглютинирующим, только выпускаются они с высокими титрами, не ниже 1:100000, что достигается более длительной иммунизацией животных. Небольшие дозы (0,5 мл) антигена вводятся в течение 2-3 недель по 3 дня подряд с перерывом в 4 дня. Более массивные дозы (1-2-3 мл) вводятся с интервалами в 4-6 дней по 8-12-16 раз. Значительной эффективностью обладает разделение иммунизации на несколько циклов, из которых один производится внутривенно (6-8 инъекций по 1-2 мл), а другой — крупными дозами внутрибрюшинно (6-8 инъекций по 3-5 мл). Кровопускание производится на 8-12-й день после последнего введения антигена. Полученная сыворотка консервируется добавлением 1-2 % сухой борной кислоты или 0,5 % хлороформа. Готовый препарат контролируют на специфичность, стерильность и высоту титра. При титровании преципитирующей сыворотки определяется то предельное разведение антигена, которое может быть обнаружено при помощи цельной или разведенной иммунной сыворотки.
Гемолитическая сыворотка
Гемолитическая сыворотка представляет собой сыворотку кролика, иммунизированного отмытыми эритроцитами барана. Гемолитическая сыворотка самостоятельно для серологического диагноза инфекционных болезней не применяется, а используется как составная часть гемолитической системы при постановке реакции связывания комплемента.
Иммунизация кроликов проводится отмытыми эритроцитами барана с интервалами в 48 часов. Каждый кролик получает в ушную вену 4 инъекции бараньих эритроцитов в повышающейся концентрации:
1 инъекция-3 мл 25 % взвеси бараньих эритроцитов,
2 инъекция-3 мл 50 % взвеси бараньих эритроцитов,
3 инъекция-3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов,
4 инъекция-3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов.
Через 6 дней после последней инъекции у кроликов берется кровь из ушной вены в два приема с интервалом в один день в количестве 60-80 мл. Кровь оставляется при комнатной температуре на 1-2 часа, затем при температуре 3-6 °С на 20-24 часа. На следующий день сыворотку отсасывают после центрифугирования в стерильную колбу.
Полученная гемолитическая сыворотка инактивируется 30 минут при 55-56 °С и консервируется добавлением сухой борной кислоты из расчета 3 % или карбол-глицерина из расчета 100 мл консерванта на 1 литр сыворотки.
Консервированная сыворотка выдерживается в леднике в течение 5 дней, после чего титруется.
Титром гемолитической сыворотки называется се максимальное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3 % взвеси бараньих эритроцитов в присутствии 0,5 мл разведенного комплемента в течение 1 часа при температуре 37 °С.
Гемолитическая сыворотка должна быть прозрачной с титром не ниже 1:1200, способной лизировать бараньи эритроциты только в присутствии комплемента. Гемолитическая сыворотка разливается в ампулы емкостью 1-2 мл и хранится при температуре 3-5 °С. Срок годности 6 месяцев.
Антивирусные сыворотки
Диагностические антивирусные сыворотки получили широкое распространение для определения вида и типа выделенного вируса. Изготовление антивирусных диагностических сывороток не отличается от изготовления антибактериальных.
Получение антивирусных сывороток проводят на определенном виде животных (кролики, морские свинки, крысы и др.), что связано с особенностями того или иного вируса. Животные, чаще кролики, иммунизируются живым или инактивированным вирусом:
После нескольких иммунизаций у животных берут кровь и определяют количество антител в сыворотке. Сила диагностической противовирусной сыворотки определяется ее титром, т.е. наибольшим разведением, дающим соответствующую реакцию иммунитета.
Диагностические антивирусные сыворотки используются в постановке реакций преципитации, связывания комплемента, нейтрализации вируса и реакции торможения гемагглютинации. Наибольшее распространение получили реакции нейтрализации, связывания комплемента и торможения гемагглютинации.
Люминесцирующие сыворотки
Люминесцирующие сыворотки применяются для микробиологической диагностики ряда инфекционных заболеваний, а именно для обнаружения бактерии, вирусов, риккетсий и простейших, для определения локализации антигенов в организме, тканевых срезах и пр. Во многих микробиологических исследованиях широко используется метод люминесцирующих антител. Этот метод, основанный на сочетании иммунологической специфичности реакции между антигеном и антителом и люминесцентной микроскопии, позволяет обнаруживать и идентифицировать бактерии, вирусы, риккетсии, грибки, простейшие и растворенные антигены в микроскопическом препарате.
Люминесцентно-серологический метод обладает высокой чувствительностью, достаточно специфичен, отличается простотой проведения и позволяет быстро получить ответ.
Люминесцирующие сыворотки готовят из специфических иммунных сывороток, которые в свою очередь получают подобно агглютинирующим и преципитирующим сывороткам. Из них извлекают глобулиновую фракцию методом высаливания сернокислым аммонием. Полученные глобулины обрабатывают флюорохромами, изоцианатом флюоресцеина или изотиоцианатом флюоресцеина в соотношении 3 мг красителя на 100 мг белка. Обработанные таким образом белки-антитела обладают способностью люминесцировать (светиться) в ультрафиолетовых или фиолетово-синих лучах. Такие люминесцирующие антитела используются для обнаружения соответствующего микроба (антигена). Наличие и локализация микробов (антигена) в микроскопическом препарате выявляются в результате реакции антиген — антитело. Продукт этой реакции ярко люминесцирует и может быть открыт даже в отдельных участках клеток и в единичных бактериях. Единичные клетки возбудителей могут быть идентифицированы в мазках па фоне обильной посторонней микрофлоры.
Помимо описанных люминесцирующих сывороток в микробиологической практике широко применяются люминесцирующие нормальные сыворотки разных видов животных и человека. Эти сыворотки используются при непрямом методе определения антигенов и антител. Они служат для обнаружения комплексов антиген 4-антитело и являются антисыворотками против глобулинов сыворотки того вида животного, которое иммунизировалось для получения специфической сыворотки. В основном применяется люминесцирующая противокроличья сыворотка, иногда люминесцирующие противолошадиная и противочеловеческая сыворотки.
Непрямой метод использования люминесцирующих антител заключается в том, что на препарат, содержащий микроба (антиген), наносят специфическую иммунную сыворотку. Молекулы гамма-глобулинов из примененной сыворотки, взаимодействуя с гомологичным антигеном, специфически адсорбируются в местах локализации его и обнаруживаются с помощью люминесцирующей антигамма-глобулиновой сыворотки.
Получение люминесцирующей противокроличьей или противолошадиной сывороток осуществляется путем иммунизации петухов (в первом случае) или кроликов, ослов гамма-глобулиновой фракцией нормальной сыворотки. Полученная видовая иммунная сыворотка обрабатывается флуорохромами.
Люминесцирующие диагностические сыворотки, высушенные методом лиофильной сушки, сохраняют свою активность при комнатной температуре более года.
В настоящее время разработаны методы производства люминесцирующих глобулинов: антирабического, сыпно-тифозного, Ку-риккетсиозного, бруцеллезного, туляремийного, сибиреязвенного, противочумного, дизентерийного (Зонне и Флекснера), холерного и др., а также люминесцирующих антисывороток, против глобулинов кролика, морской свинки, лошади, барана и человека — для непрямого иммунолюминесцентного метода.
Комплемент
Комплемент — это совокупность нескольких нормальных компонентов свежей сыворотки с различными физико-химическими свойствами. Природа комплемента не вполне ясна.
Он содержится в большинстве сывороток теплокровных и холоднокровных животных. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотке морских свинок, поэтому последние и служат в лабораториях донорами комплемента.
Основным свойством комплемента является его способность вызывать лизис клеток, сенсибилизированных соответственными иммунными сыворотками, а также адсорбироваться системами антиген + антитело.
Комплемент широко применяется в медицинской и ветеринарной практике для серологической диагностики ряда инфекционных заболеваний в постановке реакции связывания комплемента (сифилис, гонорея, бруцеллез, сап, туляремия, проказа, актиномикоз, риккетсиозы, грипп, клещевой энцефалит и др.).
Для получения комплемента используются морские свинки весом 400-600. Кровь у них берут из сердца в количестве 6-8 мл, после чего подкожно вводят физиологический раствор. Взятие крови у одной и той же морской свинки производится не чаще 1 раза
в 15-20 дней. Для получения одной серии комплемента делается смесь сыворотки от 30-50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше
способом.
Консервантом в жидком комплементе является смесь из 4,5 % раствора борной кислоты и сернокислого натрия. Сила комплемента определяется его титром, т.е. наименьшей дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки реакций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20-30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, так как в реакциях активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами (антигеном, сывороткой).
Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он должен быть прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорбироваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным.
Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при температуре 3-6 °С и в высушенном состоянии со сроком годности в 3-4 года.
Препарат сухого комплемента сохраняется при обычной комнатной температуре.
Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)